Selección de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico para la fermentación en matrices vegetales

Abstract

Las bacterias ácido lácticas (BAL) son microorganismos considerados GRAS (Reconocidas Generalmente como Seguras) según la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Se clasifican dentro del phylum Firmicutes, clase Bacilli, orden Lactobacillales y se encuentran habitualmente en vegetales, productos lácteos, alimentos fermentados y en el tracto gastrointestinal humano y de animales. Dentro de este grupo existen varios géneros utilizados en la industria alimentaria como “starters” y/o probióticos, entre ellos Lactobacillus, recientemente reclasificado en 25 nuevos géneros, y Leuconostoc. Según la Food and Agriculture Organization/World’s Health Organization (FAO-OMS) los probióticos son microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren beneficios para la salud del consumidor. Entre los efectos beneficiosos que se atribuyen a los probióticos se incluyen la regulación del equilibrio microbiano en el tracto gastrointestinal, reducción del colesterol, alivio de los síntomas de intolerancia a la lactosa, reducción de cáncer de colon, mejora de la biodisponibilidad de los nutrientes, incremento de la respuesta inmunológica y aumento de la absorción de calcio. Tradicionalmente estos microorganismos fueron utilizados por la industria alimentaria en la elaboración de alimentos lácteos y cárnicos, dejando excluidos de sus beneficios, por consiguiente, a los consumidores veganos, vegetarianos, intolerantes a la lactosa, o con dietas exentas de colesterol. No obstante, actualmente se comenzó a utilizar cultivos iniciadores en la fermentación de matrices vegetales y rápidamente convirtieron en una alternativa prometedora, ya que pueden proveer compuestos nutricionales y una microbiota beneficiosa al consumidor. En los últimos años se ha observado creciente interés de los consumidores por alimentos funcionales con probióticos, debido a sus beneficios para la salud. En Argentina, el consumo de estos sólo está asociado a productos lácteos, principalmente el yogurt. Por lo cual, la oferta de alimentos funcionales de matrices vegetales brindaría nuevas opciones a los consumidores. El objetivo principal del trabajo fue la selección de BAL con potencial capacidad probiótica para producir alimentos vegetales fermentados en procesos controlados, que den origen a productos de calidad estable y con propiedades beneficiosas para la salud. Se evaluó el potencial probiótico, la seguridad y las propiedades tecnológicas de 11 cepas de Lactiplantibacillus y cuatro de Leuconostoc aisladas de fermentaciones espontáneas de brasicáceas, pertenecientes al Cepario del Laboratorio de Biotecnología Bacteriana (LBB) (FCNyCS – UNPSJB, Sede Trelew). Las cepas de Lactiplantibacillus argentoratensis (RCTw111 y PCTw261) y L. plantarum (AKTw180 y AKTw335) demostraron resistencia a las condiciones imperantes en el tracto gastrointestinal mediante la simulación in vitro. Tres cepas de L. argentoratensis (RBTw102, RBTw249 y PCTw270) y dos de L. plantarum (RCTw106 y RBTw256) no exhibieron resistencia a pH 2,5; sin embargo, fueron capaces de resistir una concentración de bilis de 1%. Diez cepas de Lactiplantibacillus spp. presentaron actividad inhibitoria contra Listeria sp. Y Lactococcus lactis mediante la técnica de difusión en placa. Sin embargo, no presentaron actividad inhibitoria contra los microorganismos Gram positivos y negativos evaluados mediante la técnica de la doble capa. Esto puede deberse a que en un medio de cultivo líquido la producción de metabolitos como las bacteriocinas es mayor que en un medio sólido y, además su difusión es menor. Posteriormente se evaluó mediante PCR la presencia de seis plantaricinas en las cepas con actividad inhibitoria. Las plantaricinas EF, K, A, C y N se detectaron en nueve cepas, mientras que el gen plnJ solo en seis de ellas; L. plantarum RCTw106 exhibió resultados negativos. Luego, se determinó que las cepas de BAL resultaron compatibles entre sí debido a que ninguna inhibió el crecimiento de la otra mediante el ensayo de difusión en placa. Se observó una capacidad de autoagregación mayor en cuatro cepas estudiadas: Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum RBTw100, L. pentosus AKTw332, L. plantarum AKTw180 y AKTw335 (p < 0,01), superando el 60%. Respecto a la capacidad de co-agregación, ocho cepas de Lactiplantibacillus spp. y dos de Leuconostoc spp. exhibieron una capacidad mayor al 60% con Escherichia coli ATCC 25922 (p < 0,01). Mientras que, frente a Staphylococcus aureus ssp. Aureus ATCC 25923 la cepa L. plantarum AKTw335 presentó una capacidad de co-agregación mayor al 90% (p < 0,01). Mediante el método de adhesión a solventes no polares se evaluó la hidrofobicidad de las superficies celulares. En general, se observó que las cepas de Lactiplantibacillus spp. exhibieron un mayor carácter hidrofóbico al compararlas con las de Leuconostoc spp. En particular, las cepas L. pentosus AKTw332 y L. plantarum AKTw335 resultaron fuertemente hidrofóbicas, mientras que L. argentoratensis PCTw270, L. plantarum RCTw106 y AKTw180 exhibieron una hidrofobicidad moderada (≥ 41,86%) (p < 0,01). Se observó la misma tendencia respecto a la actividad β-galactosidasa, las cepas de Lactiplantibacillus spp. exhibieron mayor actividad que las de Leuconostoc spp. (p < 0,01). No obstante, se obtuvieron diferencias significativas entre las cepas de Lactiplantibacillus spp. estudiadas, de las cuales siete presentaron una actividad más elevada (p < 0,01). Por otro lado, se evaluó la seguridad de las BAL, ninguna de las cepas analizadas presentó actividad gelatinasa o hemólisis, condición sine qua non para su utilización como starter en la industria alimentaria. Luego, se determinó de forma cualitativa la producción de aminas biógenas por parte de las BAL seleccionadas. Se determinó que las cepas no exhibieron producción de tiramina ni cadaverina, sin embargo, todas resultaron positivas para histamina. Por otra parte, se evaluó la sensibilidad a los antimicrobianos siguiendo las recomendaciones del Clinical Laboratory Standars Institute y respetando los puntos de corte establecidos por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria. Todas las BAL mostraron sensibilidad a gentamicina, kanamicina, estreptomicina, eritromicina y clindamicina, mientras que, las cuatro cepas de Leuconostoc sp. y L. plantarum RCTw106 exhibieron sensibilidad a tetraciclina. No obstante, frente al cloranfenicol y a la ampicilina todas las cepas de BAL resultaron resistentes. A futuro se deberá evaluar el tipo de resistencia mediante pruebas genéticas para determinar si representan un riesgo para la salud del consumidor. Posteriormente, se evaluaron las propiedades tecnológicas de las BAL; 14 cepas exhibieron producción de exopolisacáridos mediante el método en placa, solo la cepa L. pentosus AKTw332 mostró resultados negativos. En el ensayo de solidificación de leche a 37 ºC con diferentes porcentajes de sacarosa del 20%, 10%, 5% y 0%, se obtuvo que 14, 13, 12 y 11 cepas lograron solidificar completamente el medio, respectivamente; en el último caso solo fueron representantes del género Lactiplantibacillus. Mientras que, a 18 ºC, solo cuatro cepas exhibieron una solidificación completa de la leche, AKTw112 y AKTw180 con 10% y RBTw249 y PCTw261 con 20% de sacarosa, todas pertenecientes al género Lactiplantibacillus. Sin embargo, ninguna cepa exhibió una solidificación completa de la leche suplementada con 5% y 0%. Los resultados de capacidad antioxidante evaluada mediante reducción del radical libre 2,2- Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) mostraron que las cepas de Leuconostoc presentaron una actividad menor que las de Lactiplantibacillus (p < 0,01). Sin embargo, con el ensayo de capacidad antioxidante sobre el cobre (CUPRAC) no se observó diferencia entre los géneros (p > 0,01); las cepas de Lactiplantibacillus RBTW102, RCTw106, RCTw111 y AKTw180 exhibieron una capacidad significativamente mayor (p < 0,01). Los métodos utilizados exhibieron resultados diferentes entre los géneros evaluados, esto podría ser consecuencia de los distintos sistemas de barrido de radicales que presentan los microorganismos y el mecanismo de detección de las técnicas. Es importante destacar que, en comparación con las fermentaciones de base láctea, las que usan vegetales como materia prima se encuentran aún sub-exploradas y representan nichos ecológicos muy valiosos para el aislamiento de microorganismos con potencial tecnológico y/o probiótico. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el aislamiento de cepas y su posterior estudio de propiedades fisiológicas y/o metabólicas podrían constituir una herramienta válida para la selección de BAL utilizables en la fermentación controlada de vegetales.